循环肿瘤 DNA 检测在乳腺癌诊治中的临床应用

王文彦 ¹，王昕 ²，王翔 ²

( ¹ 首都医科大学附属北京天坛医院乳腺科，北京 100050; ² 国家癌症中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院乳腺外科，北京 100021)

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基金项目:中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2016-I2M-1-001)

作者简介:王文彦. 博士. 研究方向:乳腺肿瘤的综合治疗.

通讯作者:王 翔. 教授，主任医师，博导. 研究方向:乳腺肿瘤.

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Clinical application of circulating tumor DNA detection in the diagnosis and treatment of breast cancer

WANG Wen-Yan ¹ ，WANG Xin ² ，WANG Xiang ²

¹ Department of Breast Surgery，Beijing Tiantan Hospital Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100050， China;

² Department of Breast Surgery，National Cancer Center/Cancer Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100021，China

【Abstract】Breast cancer is one of the most common malignancies in women in China，and the second malignancy in female mortality in China. With a high degree of heterogeneity，the current diagnosis and treatment of breast cancer has entered the era of individual diagnosis and treatment under the guidance of molecular classification. Circulating tumor DNA(ctDNA) has been consid-ered to be metastatic biomarkers with large amount of genetic information，which is stable，and has high specificity and sensi-tivity. Its mutations come from somatic mutations of tumor cells，which may better overcome tumor heterogeneity. In the field of breast cancer，ctDNA is a hotspot in recent years. Lots of research on the ctDNA has provided evidence-based medical evidences for early diagnosis，monitoring efficacy，drug resistance and other fields. In this study，we review the biological characteristics detection methods and progress of ctDNA in the field of breast cancer，and make a summary to its further application.

【Keywords】breast cancer; ctDNA; diagnosis; treatment

【摘 要】乳腺癌是我国女性最常见恶性肿瘤之一，也是我国女性死亡率第二的恶性肿瘤. 乳腺癌具有高度异质性，目前乳腺癌相关诊疗已进入分子分型指导下的个体化诊疗时代. 循环肿瘤 DNA 是一种信息量较大、稳定，特异性和灵敏度均较高的转移性生物标记，其突变来自肿瘤细胞的体细胞突变，能够较好地克服肿瘤异质性. 在乳腺癌领域，循环肿瘤 DNA 是近年来的研究热点，为早期诊断、监测疗效、探索耐药等方面提供了循证医学证据. 本研究对循环肿瘤 DNA 生物学特性、检测方法及其在乳腺癌领域的研究进展进行综述，并对其今后应用作出展望.

【关键词】乳腺癌;循环肿瘤 DNA;诊断;治疗

【中图分类号】R737.9              【文献标识码】A

0 引言

　　乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，最新的全国肿瘤登记年报表明，乳腺癌高居我国女性恶性肿瘤发病率的第一位，发病率为 32.43/10 万，死亡率 8.62/10 万，目前已成为女性死亡率第二的恶性肿瘤. 其中，城市女性乳腺癌发病率约为 53.87/10 万，农村女性发病率约为 40.14/10 万，乳腺癌的发病率每年递增约4% ^[1] . 由此可见乳腺癌在我国属于常见病和多发病，严重影响妇女身心健康，甚至危及生命. 乳腺癌的早期诊断、疗效随访及动态监测一直是临床及科研工作重点. 循环肿瘤游离 DNA ( circulation tumorDNA，ctDNA)是指循环血液中肿瘤细胞释放的 DNA片段，可以反应肿瘤负荷，同时携带大量肿瘤生物学行为相关信息^[2] . 循环肿瘤 DNA 的检测具有无创性、可重复性的特点，因此又被称为“液体活检”.2015 年 Nature 杂志将“发现能够指导乳腺癌治疗的分子生物标志物”作为乳腺癌研究的 4 个重要问题之一^[3] ，ctDNA 成为了近期乳腺癌相关研究的热点.本文对 ctDNA 生物学特性、检测方法及其在乳腺癌领域的研究进展进行综述，并对其今后应用作出展望.

1 生物学特性

　　ctDNA 是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA，是血浆游离 DNA (cell-free DNA，cfDNA)的一种，主要来源于坏死的肿瘤细胞及上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)过程中播散的肿瘤细胞^[4] . cfDNA 并不是一整条或者随机进入血液的，它们有自己的载体———核小体. 核小体以单个、双联或者三联的形式进入血液，并逐步分解. 大部分的 cfDNA 长度约为 166 bp. 超过 90%的健康个体每毫升血浆中的 cfDNA 量不超过 25 ng，而肿瘤患者 cfDNA 水平明显升高至 180±38 ng/mL，其主要为ctDNA [5] .

　　ctDNA 的半衰期从 0. 25 小时到数小时不等.ctDNA的清除过程分为快速清除阶段及缓慢清除阶段. 血浆核酸酶是 ctDNA 清除过程中的主要核酸酶，但对蛋白复合体作用有限，因此蛋白复合体可使 ctDNA免于降解，部分肿瘤患者血浆中核酸酶活性降低，导致 ctDNA 浓度升高^[6] . 据报道，健康人血浆中 ctDNA含量为 3～63 ng/mL，肿瘤患者为 122～462 ng/mL，乳腺癌患者 ctDNA 浓度平均为 105.2 ng/mL，高于健康人群，并且患者术后 ctDNA 水平明显下降，平均为59.0 ng/mL. 伴有淋巴结转移或远处转移的患者血浆ctDNA 浓度升高，这提示了 ctDNA 浓度可能与肿瘤负荷相关^[7] . 因此，可以采用无创性检测 ctDNA，实时监测肿瘤患者癌组织状态.

2 检测方法

　　癌组织中混杂着不同肿瘤干细胞来源的亚克隆及正常组织细胞，因此，组织向血液中所释放的cfDNA既包括肿瘤来源 DNA，也包括正常细胞来源的DNA. 提取外周血循坏中的 cfDNA 指从血浆或血清中提取 DNA，其中血清中 cfDNA 含量高于血浆，然而血清中 cfDNA 浓度升高主要与血液凝结过程中白细胞破裂释放的大量 DNA 有关，与肿瘤释放的 ctDNA水平无显著关联^[8] . 因此，血浆中提取 cfDNA 较血清中提取 cfDNA 更为可靠. cfDNA 的浓度随着静置时间的延长而显著增加^[9] ，因此对样本的保存时间提出了较高的要求，样本保存时间不一致可能导致检测结果出现偏差.

　　cfDNA 片段大小存在较大差异，提取的方法也不同. 目前 cfDNA 主流的提取试剂盒对比研究发现，QIAGEN(QIAamp circulating nucleic acid kti)提取率最高. 并且，cfDNA 定量分析与靶基因相关，比如TERT 基因所测得的浓度比 ERV3 高出 1 倍，使用的是 GeNorm 方法进行多个参考基因分析，通过平均值计算总 cfDNA 量更为可靠[10] . cfDNA 的定量检测目前尚无统一操作标准，参考 STARD 制定的 cfDNA 检测标准流程使得不同实验室之间检测结果具有可比性^[11] .

　　目前针对 ctDNA 进行的定性分析包括肿瘤特异突变检测、基因拷贝数改变、杂合性缺失、微卫星不稳定及甲基化检测等. 传统聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 灵敏度有限，不能满足 ctDNA扩增要求. 一些经过改良的实时定量 PCR 技术如扩增组织突变系统、等位基因特异扩增、肽核酸钳制PCR、双向焦磷酸水解激活 PCR 等，可将针对已知突变位点检测的灵敏度提升至 0.1% ～0.01% ^[12-13]. 新兴的数字液滴 PCR(droplet digital polymerase chainreaction，ddPCR)技术实现了单分子 DNA 的绝对定量，进一步提高了检测灵敏度. BEAMing 技术结合数字 PCR 及流式技术，可对数以万计的 DNA 进行评估^[14] . 上述技术具有良好的灵敏度和成本效益，适用于突变位点已知并且数目较少的情况，此外也可用于检测甲基化异常.

　　二代测序(next generation sequencing，NGS) 为ctDNA 定性分析提供了可靠手段. 二代测序不仅能够确定已知突变，还可以通过全外显子或基因组测序后与现有癌症基因数据库进行比对分析发现未知突变位点并进行个体化监测. 此外，二代测序还可以对基因拷贝数变化、基因重排、基因融合等改变进行分析. 由于 DNA 含量低，通常需要在测序前对目标基因进行特异性 PCR 扩增后再测序，以增加测序准确度，如 TAm-Seq、Safe-SeqS 等方法^[15] . 新近报道的癌症个体化深度测序(CAPP-Seq)通过检索肿瘤基因突变数据库 (catalogue of somatic mutations in cancer，COSMIC)寻找非小细胞肺癌复发突变相关外显子，再从肿瘤基因图谱库(the cancer genome atlas，TCGA)的全基因组测序结果筛选 ^[16] . 研究表明即使 ctDNA比例低至 0.02%也能够被检测到.

3 ctDNA 是反映肿瘤遗传特性的分子标志物

　　恶性肿瘤与基因突变存在密切的联系，基因突变包括点突变、甲基化、基因扩增等多种形式，主要出现在恶性肿瘤的发生、发展过程中. 致病性突变需要通过活检或手术切除肿瘤标本进行检测，但均属于有创性检查. 循环肿瘤 DNA 具有与肿瘤组织相同的遗传学特征，是传统的基因检测方法的补充，对于原发灶已切除的患者，ctDNA 可以作为疗效监测、预测预后的指标. Bettegowda 等[17] 发现，ctDNA 可在超过 75%的转移性胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌和肝癌及头颈癌中检测到. Ocaa 等^[18] 通过对 39 个临床试验4052 名肿瘤患者进行 meta 分析证实，实体肿瘤患者ctDNA 水平高者生存率明显降低.

　　ctDNA 的突变来自肿瘤细胞的体细胞突变，能够较好地克服肿瘤异质性问题. 来源于坏死肿瘤细胞的 cfDNA 片段更长，因此可以利用较长与较短cfDNA 片段数量的比值，即 cfDNA 的完整性来评价其中较长片段所占比例. 血清 cfDNA 的完整性在肿瘤体积大、淋巴结转移多的患者中明显升高，在出现远处转移肿瘤患者中也明显升高 ^[7，19] . Nie 等^[20] 发现在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)中 ctDNA 与淋巴结受累具有显著关联. 因此，循环肿瘤 DNA 对于肿瘤转移、复发的评价具有一定的临床意义.

　　肿瘤化疗的耐药发生与基因突变关系密切. 肿瘤患者术后需要一种无创的活检方法检测化疗中耐药的发生发展，循环游离 DNA 成为目前最好的选择.Murtaza 等^[21] 对 6 例癌症患者进行了连续血浆标本收集，随着化疗的进行，发现一些与癌症发生及耐药相关的基因突变位点的等位基因频率明显增加，甚至有一些新的突变位点产生. 这证实了肿瘤在化疗过程中是不断变化的，同时也为监测癌症的治疗效果、指导用药提供了可靠的依据.

　　循环肿瘤细胞检测在肿瘤诊断、疗效评价中的应用也具有一定的潜力. 循环肿瘤细胞 (circulating tumor cell，CTC)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，大部分 CTC 在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险 ^[22] . 美国联邦药品监督管理局(Federal Drug Association，FDA)已经批准了 CTC 检测技术 CellSearch  ，用于监测转移性乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌患者 ^[23] . 然而，SouthWest肿瘤小组研究发现，CTC≥5 个/7.5 mL 的转移性乳腺癌患者与 CTC<5 个/7.5 mL 的患者相比没有生存期差异. 因此，应用 CTC 检测评价肿瘤患者预后仍存在争议^[24] .

　　与 ctDNA 相比，CTC 检测提供了完整的肿瘤细胞，能够应用多种 DNA、RNA 和蛋白质组学测定方法更全面地了解癌症过程 ^[25] . 然而，CTC 的使用受到稀释、分离困难等技术条件的限制. 绝大多数早期乳腺癌患者中无法检测到 CTC，仅在约 20%的转移性乳腺癌患者中检测到 CTC，极大地限制了临床应用 ^[26] .并且，研究显示 CTC 和匹配肿瘤细胞之间存在一定差异，分子生物学特征研究结果可靠性不足 ^[27] . 鉴于以上问题，ctDNA 与 CTC 相比能够更好地了解癌症突变特征. 随着分子技术的持续改进，CTC 和 ctDNA未来将在癌症临床管理中相互补充 [25] .

4 ctDNA 在乳腺肿瘤诊治中的研究进展

　　ctDNA 作为一种新的肿瘤标志物，在乳腺肿瘤的诊断、预后评价、耐药性监测等方面具有广阔的应用前景. 目前乳腺癌筛查主要手段是乳腺超声及钼靶检查. 然而，仪器限制、临床经验、影像学检查手段可能导致漏诊或过度诊断可疑病变 ^[28] . 因此，探索灵敏、精确诊断良性和恶性疾病的肿瘤标记物是近年来的研究热点.

　　目前，许多研究者希望通过量化 ctDNA 水平区分乳腺良恶性疾病. Zanetti-Dllenbach 等^[29] 使用实时 PCR 技术检测乳腺癌、良性乳腺疾病和健康对照人群中 GAPDH 基因的血浆和血清 ctDNA. 与良性疾病或健康对照相比，恶性肿瘤患者血浆中的 ctDNA显着升高，但恶性和良性疾病血清中的 ctDNA 没有显著差异. Catarino等^[8] 对 175 例Ⅰ～ Ⅳ期乳腺癌患者及 80 例健康对照女性的 hTERT 基因的血浆 ctD-NA 进行检测，结果同样证实 ctDNA 在乳腺癌患者中显著升高 (10.52 vs 77 ng/mL). Gong 等^[30] 进一步对GAPDH 基因的 ctDNA 水平进行验证，对 200 例乳腺癌、100 例良性乳腺疾病和 100 例健康女性进行检测，设定 ctDNA 临界浓度为 471 ng/mL，乳腺癌诊断敏感性为 89%，特异性为 94%. Wu 等^[31] 使用定量PCR 测量血浆端粒 ctDNA 水平，与健康对照相比发现，乳腺癌患者端粒 ctDNA 显著降低，灵敏度为91%，特异性为76%. 然而，以上研究结果受到血清与血浆、量化 ctDNA 的特异性基因、技术差异以及肿瘤患者分期等因素影响，研究结果仍存在一定争议，因此，单独使用 ctDNA 浓度定量筛选和检测恶性肿瘤仍需谨慎应用于临床中.

　　一些研究者希望通过检测 ctDNA 中肿瘤相关特异性突变进行癌症筛查. Chimonidou 等^[32] 在 13% ～40%的乳腺癌患者中发现血浆 ctDNA 中的 CST6 启动子甲基化. Dulaimi 等[33] 在 70%乳腺癌患者的血清中发现一种或多种启动子 RASSF1A，APS 和 DAP 激酶的高甲化. Schwarzenbach 等^[34] 使用 PCR 方法检测了四种多态性标志物的杂合性损失(loss of heterozy-gosity，LOH)，在 19%的乳腺癌患者中发现了所有标记的 LOH. Leary 等^[35] 对 10 例乳腺癌或结肠直肠癌患者和 10 例健康对照组患者的血浆 ctDNA 进行全基因组分析并测序，使用重排末端的个性化分析(personalized analysis of rearranged ends，PARE)，发现肿瘤患者 ctDNA 中存在特异性基因结构性改变，例如 ERBB2 和 CDK6 的扩增，进一步研究证实来自癌症患者的所有血浆样品存在染色体增益或损失.目前，ctDNA 中肿瘤特异性突变检测特异性接近100%，然而经济成本较高. 随着技术的改进，时间-经济成本的降低将有利于检测更多突变位点，更加有效地为临床工作服务.

　　Dawson 等^[36] 首次报道了循环肿瘤 DNA 在乳腺癌患者预后监测中的应用. 该研究同时应用了 dPCR及高通量测序，检测血浆循环游离 DNA 中与乳腺癌发生发展相关的体细胞突变(PIK3CA、TP53 等基因突变)，携带乳腺癌相关体细胞突变的拷贝被认定是循环肿瘤 DNA. 在对 30 例携带 PIK3CA、TP53 基因突变患者的循环肿瘤 DNA 水平进行分析后发现，循环肿瘤 DNA 水平的变化与该患者的治疗及预后情况基本一致. 该研究亦将血液中的 ctDNA、CA15-3、循环肿瘤细胞 3 个生物学指标进行了对比，发现 ctDNA检测的敏感性和特异性均高于后两者. 该研究对于循环肿瘤 DNA 的临床应用无疑起到了巨大的促进作用，但由于检测敏感性低、成本高等原因，ctDNA 目前尚未大规模应用于临床. Garcia-Murillas 等^[37] 对 55位接受手术和化疗的乳腺癌患者的术后血浆 ctDNA进行动态监测，结果表明 ctDNA 比影像学检查更早提示肿瘤复发转移.

　　ctDNA 甲基化状态的检测对乳腺癌治疗和预后有一定的价值. 甲基化状态异常也被认为是癌症发生的原因之一. 在血清中检测乳腺癌患者 MDR1 基因 CpG 岛的甲基化发现低甲基化水平与肿瘤体积大、分期晚相关^[38] . 甲基化状态也可作为评价治疗效果和预后的指标之一. 在血清中检测 RASSF1A 基因的甲基化状态可作为影响他莫西芬疗效的独立因素，携带 RASSF1A 基因甲基化患者的复发率和死亡率较高^[39] .

　　乳腺癌的诊断治疗已进入分子分型时代，约70%以上的乳腺癌为雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progestogen receptor，PR)阳性，内分泌治疗已成为乳腺癌综合治疗的重要措施之一.然而，约 30%受体阳性的患者存在原发耐药，乳腺癌患者内分泌治疗耐药机制的问题成为临床急需解决的重要问题. 目前，相关研究表明雌激素受体 α 基因(estrogen receptor 1，ESR1)突变是乳腺癌发生内分泌治疗耐药的重要原因之一 ^[40-41] . Chu 等^[42] 对转移性乳腺癌患者检测血浆 ctDNA 中 ESR1 突变，并对转移灶进行全外显子测序，发现 ctDNA 中 ESR1 基因突变率超过 50%，而由于转移灶组织量不足，仅有 30%检出 ESR1 基因突变. 该研究提示乳腺癌患者监测ctDNA 可发现内分泌耐药基因突变，为临床治疗提供一定依据，对内分泌耐药基因突变的癌症患者进行早期临床干预或许可改善预后.

　　约 25%中国乳腺癌患者存在 HER-2 蛋白表达和拷贝数的增加. HER-2 基因扩增的乳腺癌患者，使用靶向治疗药物曲妥珠单抗可以显著改善预后. 相关研究表明，血浆中循环游离 DNA 可检出 HER-2 拷贝数的增加. Bechmann 等^[43] 利用 dPCR 对乳腺癌患者循环游离 DNA 中 HER-2 拷贝数的改变较准确地进行了评价，ROC 曲线下面积为 0.92. 中国医学科学院肿瘤医院马飞教授团队应用 NGS 方法对 18 例 HER-2阳性晚期乳腺癌患者 ctDNA 水平进行监测，研究结果提示，与 CT 扫描相比，动态 ctDNA 检测在鉴定抗HER-2 治疗耐药性方面灵敏度达 85.7%，特异性为55.0%，一致率高达 82.1%，进一步证实 ctDNA 检测是转移性乳腺癌抗 HER-2 耐药性监测的重要方法^[44] . 随着检测方法的不断完善，作为基因诊断的一部分，ctDNA 的 HER-2 拷贝数检测可能具有广阔的临床应用前景.

5 小结与展望

　　随着基础研究的不断深入以及转化医学的迅速发展，ctDNA 在乳腺癌诊疗过程中的作用不断被重视. ctDNA 检测简便、易行、侵害性小、实时动态佳等优势受到越来越多的关注，更全面、深入、动态地反映着肿瘤的演变过程，显示预后、预测价值的同时展现了早期诊断乳腺癌的临床价值. 但现有研究的证据力度、检测技术等多方面因素在一定程度上限制了其在临床的推广应用，需要大样本、前瞻性临床研究进一步证实对于不同类型、不同阶段乳腺癌患者的临床价值，从而真正实现乳腺癌的分类、个体化、精准治疗.

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